PRACTICA 10: IDENTIFICACION DE COCOS GRAM +

PRACTICA NUMERO 10

28/11/17

OBJETIVOS:

Poder identificar cocos gram + que pueden ser micrococus, staphilococus, aureus.

MATERIALES:

-Asas de siembra.

-Portaobjetos.

-Agua oxigenada.

PROCEDIMIENTO:

Catalasa:

-Primero para identificar si es un coco gram + se realiza la catalasa:

-Sobre un portaobjetos se deposita una colonia de 24 h., se añade una gota de H2O2  al 3%, sin mezclar con el asa y sin invertir el orden.

- El inmediato desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva.

- Las colonias se deben tomar de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados.

- Esta prueba también puede realizarse en tubo.

*El resultado es POSITIVO *

-Como la catalasa es positiva se realiza:

Oxido-fermentacion:

-Se siembra la muestra, en picadura, en dos tubos que contienen el medio de Hugh Leifson  (O/F) adicionado de un 1% glucosa.

-A uno de los tubos se añade parafina líquida estéril para conseguir anaerobiosis.

-Se incuban durante 24 - 48 horas a 37 º C.

El resultado es FERMENTATIVO ( +, +)

Al ser fermentativo ya sabemos que se trata de un Staphylococcus, ahora queremos diferenciar si se trata de un POSITIVO O NEGATIVO.

Por tanto se realiza la Cuagulasa, Manitol y DNAsa, si los tres dan positivo se trata de aureus pero si los tres dan negativo se trata de un staphylococcus.

Cuagulasa:

-En tubo: Se emulsionan bastantes colonias en un tubo

de ensayo con 0,5ml de plasma citratado. Se incuba a 37º C y se observa la formación del coágulo a las 4 horas.

-Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 – 24horas. 

*El resultado es POSITIVO.

Manitol:

•Estudia la capacidad de los microorganismos para fermentar el manitol y crecer en presencia de una elevada concentración de NaCl (Medio de Chapman)

•Cuando el microorganismo fermenta el manitol se producen metabolitos ácidos que cambian el pH del medio y el indicador (rojo fenol) vira a amarillo.

Diferencia  S. aureus del resto de los estafilococos.

*El resultado es POSITIVO.

-DNAsa:

En una placa que contiene Agar DNAsa, se siembra la muestra, haciendo una estría de unos 2 cm.

·Se incuba 24horas /37ºC.

·Se hace la lectura añadiendo ácido

HCl 1 N (que precipita el DNA), o azul de toluidina al 1%, y observando la aparición de zonas claras o coloreadas de rosa, respectivamente, alrededor de la zona sembrada.

*El resultado es POSITIVO.

AL DAR LOS TRES RESULTADOS POSITIVOS SE TRATA DE ESTAFILOCOCUS AUREUS.

OBSERVACIONES:

-Si por ejemplo queremos diferenciar de un estafilococus eipdermidis o saprophyticus se realiza la prueba de la Novobiocina.

•: Un halo de inhibición de crecimiento, menor o igual a 16mm, corresponde a S. saprophyticus.

Un halo de inhibición mayor de 16mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.

La no aparición de halo de inhibición de crecimiento indica resistencia a novobiocina.