PRACTICA 11: PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA.
PRACTICA NUMERO 11
9/01/2018
OBJETIVOS:
Realizar pruebas bioquímicas para poder realizar la identificación de bacilos Gram -.
UTILIDAD CLÍNICA:
Estas pruebas de identificación se realizan para poder distinguir entre:
-Microorganismos que crecen en medios no enriquecidos y medios para enterobacterias, al grupo de las enterobacterias o al grupo de los no fermentadores de azucares. Ej: Pseudonomas.
-Otras bacterias, que se aíslan solo como resultado de una búsqueda especifica, utilizando medios especiales; Vibrio y Campylobacter, Brucella, Bordetella y Legionella.
FUNDAMENTOS:
Los principios y reacciones en que se basan las pruebas bioquímicas son las siguientes:
-Kligler: esta prueba permite la diferenciación de enterobacterias. Esta compuesto por hierro.
Es un medio solido y contiene lactosa, glucosa, peptonas y un indicador de pH.
Vira a amarillo cuando el pH es ácido y que toma un color rojo mas intenso cuando el pH es alcalino.
La fermentación se produce tanto en condiciones anaerobias como en aerobias siguiendo varias rutas metabólicas.
El ácido sulfhídrico genera reacciones con el hierro que contiene el medio formando sulfuro de hierro que vira a color negro.
-Invic: esta formado por 4 pruebas bioquímicas ( Indol, Rojo Metilo, Voges-Proskauer y Citrato).
El Indol se usa para identificar bacterias que producen la enzima triptofanasa y por tanto son capaces de producir indol a partir del aminoácido triptofano. La presencia de indol se visualiza con el reactivo de Kovacs que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo.
El rojo Metilo se usa para identificar enterobacterias, m.o. anaerobios facultativos que pueden metabolizar la glucosa. El positivo si se desarrolla un color rojo estable.
Voges-Proskauer estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación en la cual se forma acetoina. Es positiva si pasados 15 minutos se desarrolla un color rojo que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoina,
El Citrato se utiliza para determinar la capacidad que tiene algunos m.o. para usar el citrato como unica fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la enzima citrasa. Es positivo cuando se producen un cambio de color del medio a azul.
-Test de la Urea: se utiliza para diferenciar a los m.o. capaces de hidrolizar la urea por la acción del enzima ureasa. Este enzima al hidrolizar la urea origina amoniaco, el cual produce un incremento del pH del medio que puede detectarse mediante un indicador ( rojo fenol).
Es positivo cuando el medio vira a color rosa.
-Fenilalanina Desaminasa: el aminoácido fenilalanina, por desaminacion oxidativa, se transforma en ácido fenilpiruvico, que es cetoácido que puede detectarse porque, al añadir cloruro férrico, forma un complejo de color verde. La prueba es positiva cuando aparece un color verde intenso que indica la presencia de aido fenilpiruvico.
APARATAJE:
-Estufa.
MATERIALES:
-Asas de siembra esteriles.
-Placa de petri cultivada con Citrobacter.
-Mechero Bunsen.
REACTIVOS:
-Reactivo de Kovacs.
-Rojo de metilo al 0.04%.
-Cloruro Ferrico.
PROCEDIMIENTO:
-Colocar en una gradilla los siguientes tubos:
*Klinger Iron Agar.
*Indole Broth.
*Dos tubos de MR-VP Broth.
*Simmon Citrate Agar.
*Phenylanine Agar.
*Urea Indole Broth.
-Sembrar cada tubo con el m.o. Citrobacter que se encentra cultivado en la placa de petri.
-Todos los tubos se siembran por agotamiento o suspension en el medio liquido menos Klinger que se siembra en picadura en el fondo del tubo y a continuacion se siembra en estria sobre la superficie del pico de flauta.
-Introducir los tubos en la estufa a 37ºC e incubar durante 24h.
RESULTADOS:
-Pasadas las 24 horas, estos son los resultados de cada tubo:
*Klinger Iron Agar.
Lactosa +, Sulfhidrico +,Glucosa +.
*Simmon Citrate Agar.
Ha virado a color Azul , Positivo.
*Phenylanine Agar.
Se le añade Cloruro ferrico, como no ha virado a ningun color es Negativo.
*Urea Indole Broth.
Se le añade Reactivo de Kovacs, al no producir un anillo rojo, es Negativo.
* MR-VP Broth.
Al primer tubo:
Se le añade Rojo de metilo , al quedar el tubo rojo es Positivo.
El segundo tubo
Se le añade primero el VP1 y seguidamente el VP2 y esperar 15 minutos, al seguir sin virar el resultado es Negativo.
*Indole Broth.
Se le añade el reactivo de Indole, como no cambia de color el resultado es Negativo.
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